徠卡顯微系統(tǒng) 應(yīng)用專家 肖麗國(guó)

2020年，似乎來得更艱難一點(diǎn)。從去年12月份開始，疫情就像龍卷風(fēng)一樣席卷，當(dāng)前已在217個(gè)國(guó)家地區(qū)蔓延，確診超2402萬例，死亡破82萬例。疫情構(gòu)成大流行的威脅“已經(jīng)變得非常真實(shí)”。

WHO Coronavirus Disease Overview

數(shù)據(jù)來源：World Health Organization，Date by 2:44pm CEST, 27 August 2020

疫情之下，奔跑在一線的有我們的白衣天使，也有爭(zhēng)分奪秒的科研人員。而在整個(gè)疫情的防控防治過程中，電鏡技術(shù)，讓病毒無所遁形。

負(fù)染色技術(shù)—鑒定病毒形態(tài)

為什么是冠狀病毒？

電鏡給了一個(gè)很重要的指標(biāo)：病毒形態(tài)。

1月6日，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心通過對(duì)臨床患者分離毒株樣品進(jìn)行電鏡負(fù)染色，發(fā)現(xiàn)了病毒的存在，且形狀與冠狀病毒相似，直徑80-120nm，表面有皇冠一樣的突起，這就給我們一個(gè)很重要的方向指示。隨后，根據(jù)核酸序列比對(duì)以及其他鑒定方法，宣布疫情病毒肺炎疫情爆發(fā)。

圖片來源：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心

負(fù)染色技術(shù)可以鑒別病毒形態(tài)、純度和濃度

負(fù)染技術(shù)流程簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快。一般幾分鐘就可以完成。

載網(wǎng)要求：

1、載網(wǎng)親水：商業(yè)化載網(wǎng)表面有油脂，懸液樣品鋪不開

2、碳膜載網(wǎng)：促進(jìn)樣品顆粒均勻分布

徠卡高真空鍍膜儀，一機(jī)兩用：鍍膜+輝光放電

EM ACE系列鍍膜儀（Leica EM ACE200）

負(fù)染技術(shù)—徠卡解決方案

冷凍電鏡技術(shù)—指導(dǎo)藥物和疫苗設(shè)計(jì)

疫情病毒表面的S蛋白，是侵染宿主的關(guān)鍵蛋白，與SARS病毒S蛋白一樣，都將宿主細(xì)胞表面的“血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）”作為侵入細(xì)胞的關(guān)鍵受體。了解S蛋白的結(jié)構(gòu)，弄清楚S蛋白與ACE2的作用方式，是藥物開發(fā)和疫苗設(shè)計(jì)的重點(diǎn)。

2月15日，德克薩斯大學(xué)*分校McLellan團(tuán)隊(duì)獲得了疫情病毒S蛋白三維結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)3.5埃，確定了該S蛋白是由S1和S2組成的三聚體。RBD是受體結(jié)合區(qū)域，存在多種構(gòu)象狀態(tài)。與SARS病毒S蛋白比較，兩者是不同的，但整體上仍具有較高的相似度。

隨后，作者又分別分析了兩個(gè)病毒S蛋白與ACE2的親和力，疫情病毒S蛋白與ACE2的KD（平衡解離常數(shù)）是14.7nM，SARS病毒S蛋白與ACE2的KD是324.8nM，KD越高，親和力越低，暗示著疫情病毒的傳染性要高于SARS病毒。

3月1日，華盛頓大學(xué)David Veesler團(tuán)隊(duì)根據(jù)S蛋白存在多種構(gòu)象，重構(gòu)了3.0埃的close構(gòu)象，以及3.3埃的打開單個(gè)SB區(qū)的三聚體。

結(jié)果表明，疫情病毒S胞外區(qū)表現(xiàn)為一個(gè)16nm長(zhǎng)的三聚體，三角形截面，與SARS病毒S蛋白非常相似。很多序列是保守的，設(shè)計(jì)針對(duì)這一結(jié)構(gòu)功能的抗體，可能會(huì)交叉反應(yīng)中和這兩種病毒以及其他相似的冠狀病毒。

同時(shí)還發(fā)現(xiàn)S1和S2邊界處存在四個(gè)氨基酸殘基插入，從而引入了新的蛋白酶切位點(diǎn)。這就可能會(huì)增強(qiáng)病毒的可傳播性，更加科學(xué)地解釋了疫情病毒傳染力強(qiáng)的問題。

2月19日，西湖大學(xué)周強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)獲得了ACE2的全長(zhǎng)三維結(jié)構(gòu)，同時(shí)解析了S蛋白R(shí)BD和ACE2的復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)，看清楚了它們的相互作用方式，這一步正式揭開了疫情病毒入侵人體細(xì)胞的神秘面紗。

“S蛋白像一座橋橫跨在ACE2表面，又像病毒的一只手，緊緊抓住ACE2，打開細(xì)胞大門”。

了解了鎖的結(jié)構(gòu)，接下來，就可以有針對(duì)性地設(shè)計(jì)鑰匙，設(shè)計(jì)藥物和指導(dǎo)疫苗的研發(fā)。技術(shù)流程與負(fù)染類似，但是樣品終要經(jīng)過投入冷凍，在低溫電鏡下進(jìn)行觀察。

徠卡的EM GP2，就是一款專業(yè)的投入冷凍儀，通過對(duì)樣品的單邊或雙邊的平行吸附，實(shí)現(xiàn)樣品的快速均勻冷凍。包括生物樣品，工業(yè)溶劑、懸濁液、乳濁液、膠體樣品等。

冷凍電鏡技術(shù)—徠卡解決方案

結(jié)果展示：

樣品：蛋白

觀察方式：cryo TEM

樣品：病毒

觀察方式：cryo TEM

樣品：纖維

觀察方式：cryo TEM

樣品：細(xì)菌

觀察方式：cryo TEM

電鏡是微生物研究中*的工具，病原體的確定毋庸置疑在傳染病防控中占有地位，而電鏡檢查是確定病毒顆粒的金標(biāo)準(zhǔn)。電鏡研究，制樣先行。如果您想了解更多關(guān)于電鏡制樣與病原體研究的內(nèi)容，請(qǐng)與我們聯(lián)系吧！