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光片顯微鏡（Light-Sheet Microscopy, LSM）是一種強大的三維成像技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物學研究。本文將為您科普光片顯微鏡中的不同光片技術(shù)，重點介紹主瓣、光切片、長度、分辨率、對比度和激光強度等關(guān)鍵性能指標及其相互關(guān)系。
光片顯微鏡簡介
光片顯微鏡通過在樣品上形成一層薄而均勻的光片來照明，從而獲得樣品的二維圖像。通過移動樣品或光片，可以快速獲取整個三維樣本的圖像。這種方法不僅減少了光漂白和光毒性，還提高了成像速度和深度。
主瓣與光切片：光片的“心臟"與“軀體
在光片顯微鏡中，主瓣是指光片中強度最高的區(qū)域，它直接影響著顯微鏡的軸向分辨率。主瓣越薄，理論上分辨率越高。然而，光片的光切片，即整個光片的厚度，同樣對成像質(zhì)量有著決定性的影響。光切片不僅包括主瓣，還包括可能影響對比度的旁瓣或次要結(jié)構(gòu)。
在許多先前的出版物中，未能區(qū)分光片厚度和主瓣厚度可能會導致混淆，例如在提到“通過掃描貝塞爾光束產(chǎn)生的超薄平面照明"或“超薄貝塞爾光片"時，主瓣比相同長度的傳統(tǒng)高斯光片更薄【19,25】。對于zui常用的具有高斯分布的光片來說，只有一個光片，主瓣厚度和光片厚度的測量值嚴格成比例。但如圖1 所示，這對于具有輔助結(jié)構(gòu)（如側(cè)瓣或多條平行光片）的多瓣光束并不適用。
對于多瓣光束，當僅考慮主瓣厚度時，樣品暴露的總照明功率中有相當一部分被忽略。這種額外的曝光會在光片顯微鏡中貢獻到檢測到的熒光信號，從而可能降低圖像對比度。因此，考慮以下幾點非常重要：通常顯示的沿檢測軸的 PSF 切片可以用來推斷軸向分辨率。然而，它們使觀察者無法計光學分層性能或光片厚度。
圖 1. 不同光束形狀對光片顯微鏡中軸向分辨率 dz 和光學切片 OS 影響的示意圖。
照明點擴散函數(shù)（PSF，藍色）表示照明光的強度。
檢測點擴散函數(shù)（PSF，綠色）表示熒光光子的位置依賴性檢測概率。
虛線表示等強度表面，例如，峰值的 37%。
虛紅線表示結(jié)合照明和檢測 PSF 的等表面（照明強度和檢測概率的乘積）。它沿檢測軸的范圍與系統(tǒng)的軸向分辨率成比例。
綠色陰影區(qū)域表示熒光分子被照明并收集熒光的體積。光學切片測量該體積沿檢測軸的范圍。
在 a) 中，顯示了單瓣照明光束，分辨率是各向異性的，即橫向分辨率優(yōu)于軸向分辨率，但光學切片接近軸向分辨率。
在 b) 中，顯示了多瓣照明光束，分辨率是各向同性的，但從旁瓣照明區(qū)域收集到額外的熒光信號。光學切片劣于軸向分辨率。旁瓣照亮離焦平面，使圖像模糊。
光片長度：決定視野的關(guān)鍵
光片的長度是另一個關(guān)鍵參數(shù)，它決定了可以均勻照明的樣本區(qū)域大小。較長的光片可以覆蓋更大的視野，但可能會犧牲一些分辨率。
分辨率與對比度：成像質(zhì)量的雙重奏
分辨率是衡量顯微鏡性能的基石，它決定了我們能看到的最小細節(jié)。而對比度則是圖像中亮區(qū)與暗區(qū)的差異，高對比度意味著更清晰的圖像細節(jié)。在光片顯微鏡中，主瓣的厚度和光切片的均勻性共同決定了分辨率和對比度：
軸向分辨率取決于顯微鏡點擴散函數(shù)（PSF）沿檢測軸的分布寬度
圖像對比度取決于光片的整體厚度
激光強度：照亮微觀世界的光源
激光強度是生成光片的基礎(chǔ)。不同強度的激光可以產(chǎn)生不同特性的光片。例如，高強度激光可以生成更薄的主瓣，但也可能增加樣品的光漂白和光毒性。
圖 2. 主峰厚度和光學分層的定義。展示了單峰光束 (a) 和多峰光束 (b) 的強度在 yz 方向上的橫截面。在焦點處 (紫色線) 和距離 y = L 處 (厚度加倍的地方, 藍色線) 的相應(yīng)剖面顯示在 c-j 中。c, d 和 e, f 分別說明了單峰光束 (c, d) 和多峰光束 (e, f) 的主峰厚度，定義為在焦點處強度高于最大強度 37% 的范圍，分別在焦點處 (c, e) 和距離 y = L 處 (d, f)。子圖 g-j 相應(yīng)地說明了光學切片厚度 wOS ，定義為包含光束功率 63% 的范圍。
觀察由掃描光束形成的光片時，相關(guān)的測量包括：
在檢測軸上強度shou次下降到峰值強度的一部分的距離
在距離檢測焦平面一定距離內(nèi)由光片產(chǎn)生的總熒光量
第一個測量標準提供軸向分辨率，而第二個提供對比度。軸向分辨率是沿檢測 z 軸可以分辨出兩個物體的最小距離。對比度是聚焦特征信號與背景信號（主要來自失焦特征）的差異。圖 2a 顯示了由單峰光束形成的光片的示例。圖 2c 和 2d 顯示了在光束傳播軸上兩個位置處以 1/e=37% 峰值強度測量的分布寬度，圖 2g 和 2h 顯示了標記光束總能量 63% 的積分輪廓。在強度大于峰值強度 37% 的范圍內(nèi)，高斯強度分布的光片攜帶其總能量的 84%。原因在于光片不是一個圓對稱光束，而是主要沿檢測軸向一個方向擴展。
在比較不同光片時，第一個測量標準（強度下降）與第二個測量標準（區(qū)域內(nèi)包含的能量）之間的比例與任何長度的單峰光片的比例數(shù)值無關(guān)。
對于多峰光片來說，第一個和第二個測量標準得到的值可能會有顯著差異，因為它們表現(xiàn)出更復雜的結(jié)構(gòu)。如圖 2 右側(cè)所示，強度分布降到峰值的 1/e 的距離僅反映了主峰的厚度（圖 2e, f）。因此，作者引入了“主峰厚度"這個術(shù)語來表示這個測量標準。圖 2i, j 中標示的光學分層 wOS 考慮到主峰可能不具備足夠的能量來貢獻總檢測信號的 63%。
這一測量標準給出的值明顯大于主峰厚度，更接近反映了光片的真實厚度。
性能間的關(guān)系：協(xié)同與權(quán)衡
在實際應(yīng)用中，這些性能參數(shù)之間存在著協(xié)同與權(quán)衡。例如，追求更薄的主瓣以提高分辨率可能需要犧牲一些光切片的均勻性，從而影響對比度。同樣，增加激光強度以改善信噪比，也可能帶來光漂白的風險。
不同光片技術(shù)的原理與應(yīng)用
1. 高斯光片
最常見的光片類型，以其簡單的高斯強度分布而著稱。適用于需要均勻照明的大視場成像。
2. 聚焦平坦頂光片
在焦點處提供均勻的照明，但邊緣有較弱的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，適用于需要高對比度的成像。
3. 貝塞爾光片
具有自我重建的特性，即使在復雜介質(zhì)中也能保持形狀不變，適用于需要高分辨率的成像。
4. 艾里光片
通過特定的相位調(diào)制產(chǎn)生，具有在特定方向上傳播的特性，適用于需要高對比度和高分辨率的成像。
5. 雙光束光片
通過兩個子光束的干涉產(chǎn)生，形成一系列光片，適用于深層樣品成像。
圖2. 各種光束類型相對于高斯光束的光學分層（藍色）和主瓣厚度（橙色）的比率。所有值均為光束長度 L 約為 30 µm 計算得出。插圖顯示了解釋圖表的方案。值大于 100% 表示主瓣或光學分層比高斯光束更厚。
對于所有類型的光片顯微鏡，光學切片和軸向分辨率取決于光片的長度。因此，僅在長度相等的情況下比較光片特性是至關(guān)重要的。在大多數(shù)情況下，長度是由樣品或研究人員希望在單幀中觀察的視野決定的。
因此，作者選擇首先定義光片長度的方法，然后根據(jù)它們提供的軸向分辨率和光學切片來比較光片。
將高斯光束設(shè)為參考值，作者計算了相同光束長度下不同光束類型在厚度和光學切片方面的相對增益或損失。
圖2顯示了長度為30?µm的光片的結(jié)果。數(shù)值超過100%表明光片厚度 wOS 或主瓣寬度wML大于高斯光束。
總體而言，作者發(fā)現(xiàn)對于所有光束類型，在這兩個特性之間存在權(quán)衡：制造薄光片會以高斯光束的長度或其他光片類型的光學切片為代價。
光片顯微鏡的技術(shù)選擇是一個綜合考量的過程，需要在分辨率、對比度、光切片質(zhì)量和激光強度之間找到最佳的平衡點。通過深入理解這些技術(shù)參數(shù)及其相互關(guān)系，您可以更加自信地選擇和優(yōu)化適合自己研究的光片顯微鏡技術(shù)。
光片模擬軟件軟件
作者的光片模擬器應(yīng)用程序*數(shù)值計算光片的 3D 強度分布并量化其尺寸。它可以生成高斯光束、聚焦平頂光束、艾里光束、貝塞爾光束、貝塞爾光束晶格、雙光束和球差光束，以及用戶引入的任意類型光片。該算法將光束在后焦平面的電場幅度和相位作為初始條件，使用光束傳播方法計算其在焦平面周圍的傳播。
* E. Remacha “Light Sheet Simulator" (2019) [retrieved 5 November 2019]
操作步驟
在Matlab環(huán)境中運行LightSheet_Simulator.mlapp，圖3顯示了GUI示例。有三種可能的操作：
仿 真
允許可視化光片的截面以及后焦平面的強度和相位。要模擬本文討論的光片，請在選項卡面板中選擇光束類型并輸入所需參數(shù)。要模擬自定義光片，請選擇“創(chuàng)建光片"選項卡。輸入包含后焦平面幅度和相位的文件路徑。這些文件必須以 tiff 格式提供。
分 析
在模擬光片后，按“分析"以獲得本文定義的主瓣寬度wML、光學切片厚度 wOS 和長度L 的值。
保 存
在zhi定的目錄下創(chuàng)建文件 simulated_lightsheet.m。該文件包含 3D 強度矩陣以及計算中使用的數(shù)值和物理參數(shù)。
圖3. 光束模擬器用戶界面
圖3展示了光束模擬器的用戶界面，通過這個界面，用戶可以選擇不同類型的光束進行仿真，分析結(jié)果，并保存數(shù)據(jù)。
閱讀原文：
Elena Remacha, Lars Friedrich, Julien Vermot, and Florian O. Fahrbach, "How to define and optimize axial resolution in light-sheet microscopy: a simulation-based approach," Biomed. Opt. Express 11, 8-26 (2020)
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