顯微鏡的產(chǎn)生和發(fā)展對于生命科學研究的進步有至關重要的作用，它將微觀世界呈現(xiàn)在大家面前，包括微生物的存在、組織細胞結構及生理病理活動等。顯微鏡技術的不斷革新將成像分辨率不斷提高，但相當長一段時間內(nèi)光學成像無法突破一個極限值，即xy軸橫向分辨率約200nm，z軸縱向分辨率約500nm，因此小于這個尺寸的生命活動和結構，如病毒、亞細胞結構等無法清楚地觀察到。

聚焦點的光強會根據(jù)點擴散函數(shù)（point spread function，PSF）而展開，對于圓形孔徑，PSF呈現(xiàn)為艾里斑（Airy disk）的模式。激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）的分辨率取決于PSF的大小，如果焦點很小，則每個像素點獲取到的信息也很小，從而得到清晰銳利的圖像；反之，則結果圖像變得模糊。因此，CLSM成像的主要挑戰(zhàn)在于實現(xiàn)越來越小的PSF以獲得更好的分辨率。德國物理學家恩斯特·阿貝（Ernst Abbe，1840-1905年）在19世紀70年代shou次提出阿貝衍射極限，即由于衍射效應，PSF大小與λ/NA成正比（d=0.61λ/NA），其中λ是光的波長，NA是物鏡最重要的參數(shù)——數(shù)值孔徑。由于可見光波長范圍在400-760nm之間，NA值最大在1.7左右，所以分辨率極限在200nm左右。隨著物理學和測量技術的進步，突破衍射極限的顯微鏡不斷涌現(xiàn)，gongren的超高分辨顯微鏡主要有三類，包括結構照明顯微鏡（Structured Illumination Microscopy，SIM），受激發(fā)射損耗顯微鏡（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED），和單分子定位顯微鏡（SMLM）。單分子定位顯微鏡包括光敏定位顯微鏡（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）和隨機光學重構顯微鏡（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。2014年三位科學家史蒂芬·霍爾（Stefan W. Hell）、埃里克·貝茲（Eric Betzig）和威廉·莫納（William E. Moerner）因他們在超高分辨顯微鏡技術領域的貢獻而獲得了諾貝爾化學獎。當然，新興zuidi光子數(shù)顯微成像（MINimal Photon FLUXes，MINFLUX）作為第四類超高分辨顯微鏡，也被更多的學者了解和關注。

超高分辨顯微鏡成像既利用了光學顯微成像原有的無損性質（與電鏡高分辨成像相比），又可以很好地突破普通顯微鏡中衍射極限對成像分辨率的限制，因此其發(fā)明和發(fā)展對于生命科學和生物醫(yī)學研究具有非常重要的意義。不同類型的超高分辨顯微鏡自問世后均被廣泛應用于生命科學領域中，包括生命體細胞結構和功能的探索以及疾病的發(fā)生發(fā)展機制等。不過，不同類型的超高分辨顯微鏡由于空間分辨率、時間分辨率、光漂白和光損傷等諸多問題，實際應用中各有利弊。雖然成像技術發(fā)展很快，但技術限制依舊存在，如何獲得更高的空間分辨率、更深的成像深度和更快的時間分辨率以滿足更精確更快生物過程的研究依舊任重道遠。

SIM技術的前身可以追溯到20世紀70年代初。當時，光學學家特奧多爾·赫普恩（Theodor H?upl）shouci提出了使用周期性光柵照明來提高顯微鏡分辨率的想法。這奠定了SIM技術的基礎，盡管當時還沒有實體的SIM顯微鏡。21世紀初期，SIM技術開始廣泛傳播，吸引了生物學家和顯微鏡專家的關注，它是一種相對低成本的超高分辨率成像方法，因為它不需要昂貴的激光設備或復雜的樣品準備。

SIM本質是激發(fā)光透過可橫向移動的光柵產(chǎn)生正弦條紋圖案照射樣品，正弦條紋照明圖案與樣品本身的信息疊加形成莫爾條紋，將樣品結構中的高空間頻率信息轉變?yōu)榭赏ㄟ^物鏡收集的較低空間頻率信息，最后通過后期數(shù)據(jù)處理得到樣品的高分辨圖像。SIM的單幅原始圖像的采集速度只取決于樣品的熒光信號強度和探測器的采集速度，通常只需要采集9幀原始圖像，與基于點掃描成像的STED和需要采集幾萬幀原始圖像的SMLM相比，要快得多，基本可以達到實時觀察。但SIM受其成像原理的制約，最多只能將橫向分辨率提升為傳統(tǒng)顯微鏡的2倍（即100 nm左右），因此分辨率遠不及其他超高分辨顯微鏡技術。但SIM對熒光探針沒有光開關或抗淬滅的特殊需求，其最大的優(yōu)勢也是寬場成像速度快，所以更多更廣泛地應用在活細胞成像領域。

單分子定位顯微鏡中熒光標記的單個分子被分別激發(fā)和檢測，可以jigao的精度確定單分子的中心從而實現(xiàn)高分辨率，包括光敏定位顯微鏡（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）和隨機光學重構顯微鏡（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。

PALM的歷史可以追溯到2006年，由埃里克·貝茲（Eric Betzig）和哈拉爾德·赫斯（Harald Hess）提出了單分子定位這一概念。同期STORM的成像技術也發(fā)展起來，代表是華人科學家莊小威。STORM和PALM工作原理類似，都是通過特殊的分子標記和隨機活性化，實現(xiàn)單分子定位進而實現(xiàn)超高分辨率成像。在SMLM成像中，光開關熒光蛋白（PALM）或閃爍染料（STORM）扮演著重要角色，它們在“開態(tài)"和“關態(tài)"間可以相互轉換，處于開態(tài)時可被激發(fā)產(chǎn)生熒光，而處于關態(tài)時不發(fā)射熒光。在每一個成像周期內(nèi)隨機只讓一小部分熒光團打開，其余熒光團暫時關閉，這樣每一幅圖像中熒光團的光斑不會重疊，可以高精度地定位出每個熒光團的位置。重復這個過程，使每個周期內(nèi)都隨機打開一部分熒光團，這樣可以在不同時間點捕獲標記物的位置，通過記錄標記物的位置可以得到它們的坐標，獲得足夠多的數(shù)據(jù)點可將所有的定位信息疊加起來，就能重構出一幅超分辨圖像。這種以成像時間換取空間分辨率的形式，使得PALM或STORM的分辨率通常能夠達到數(shù)十納米。

德國科學家Stefan W. Hell于1994年shouci理論上提出STED顯微鏡的概念，并在2000年進行實驗驗證。STED超高分辨技術的基礎原理是利用受激發(fā)射效應減小有效熒光發(fā)光面積，即在STED顯微成像中，通過使用一個激發(fā)光束和一個環(huán)形的耗損光束，使得熒光分子的激發(fā)區(qū)域比阿貝衍射極限更小。耗損光束通過受激發(fā)射將外圍的熒光分子去激發(fā)，只留下中心區(qū)域的熒光信號，從而實現(xiàn)納米級別的分辨率。我們也叫它“甜甜圈"技術。STED成像技術可以通過非線性效應提高分辨率，即其分辨率與STED“甜甜圈"損耗光強有關，提高“甜甜圈"光的強度可以使熒光光斑焦點中心直徑縮小，但是實際應用中，光損傷較大，“甜甜圈"光強不可能無限增加，顧其分辨率最高可達到30nm左右。此外，STED成像技術還包括對光束進行精確調制、校準和掃描，以及采用高性能探測器進行成像，加之其“甜甜圈"光毒性、光淬滅等問題比較明顯，STED技術對熒光染料和封片劑的抗淬滅要求較高。

近年來，得益于新的硬件革新及技術手段的引入、熒光染料和探針的改進、光學系統(tǒng)的優(yōu)化和更精確的成像算法等，STED技術在分辨率和應用方面都有了顯著提升，發(fā)展為易用、穩(wěn)定的成熟商業(yè)產(chǎn)品，逐步成為生物醫(yī)學領域中重要的研究工具。STED技術結合熒光壽命成像更是發(fā)揮了降低損耗光強度優(yōu)勢、打破相近波長染料不可共染的限制，進一步降低了光漂白、提高了分辨率。

STED技術的發(fā)明人Stefan W. Hell于2017年在Science上發(fā)表了他的又一個突破性技術——zuidi光子數(shù)顯微成像（MINimal Photon FLUXes，MINFLUX）。在實際成像中，激光功率不可能無限高，熒光基團的穩(wěn)定性（抗光漂白性）也不可能無限好，所以很多超分辨技術的實際分辨率是沒辦法達到理論最佳值的，但MINFLUX不是靠檢測盡可能高的熒光強度作為目的，而是以檢測到盡可能低的熒光信號為目標。MINFLUX技術結合了單分子定位顯微鏡（SMLM）和STED顯微鏡的優(yōu)勢，能以高達10kHz的頻率跟蹤分子運動，每100μs分辨一次分子運動，比傳統(tǒng)方法快100倍，并能獲得1 - 3nm（3D）的空間分辨率，可解析單分子微小結構，因此也被稱為顯納鏡。

在MINFLUX跟蹤中，環(huán)形激發(fā)光束（這里的甜甜圈光束是激發(fā)光束，而不是擦除光束）圍繞單個熒光團掃描，根據(jù)在特定位置測量的強度，計算熒光團的精確坐標，并在下一次迭代之前將掃描圖案重新定位在該位置。保持熒光團靠近光束的暗中心活動可以實現(xiàn)高定位精度并將光漂白作用最小化。通過有效利用單個熒光團的有限光子預算，MINFLUX實現(xiàn)了成像的高空間分辨率和熒光團跟蹤的高時間分辨率。

在生命科學領域，STED技術以其優(yōu)異的空間分辨率成為科學家們研究亞細胞結構及蛋白定位的強有力工具。肌動蛋白微絲、微管、線粒體和核孔復合物等細胞結構也被選為常用的標準模型來檢驗超高分辨成像系統(tǒng)的分辨率。STED超高分辨技術可以揭示核孔復合物（nuclear pore complex, NPC）在早期G1期的蛋白質組成，并使通過NPC輸出和輸入信使核糖核蛋白復合物和肽的可視化成為可能（Ashkenazy-Titelman et al., Nat Commun., 2022; Shi et al., Proc. Natl Acad. Sci., 2017）。由于DNA復制、修復和轉錄的動力學不能用電子顯微鏡來闡明，因此，核內(nèi)染色質的研究特別受益于新型STED兼容的DNA探針的發(fā)展。此外，一些染色質亞結構，如環(huán)、彎或超線圈，不能用傳統(tǒng)的衍射受限的熒光顯微鏡來分辨。用YOYO-1標記的λ噬菌體DNA進行STED成像，可分辨DNA的彎曲和扭曲，并證明其足以分辨長度相近的片段（相差約100bp）（Persson et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2011; Kim et al., Anal. Bioanal. Chem., 2016）。與Hoechst偶聯(lián)的遠紅染料可以顯示異染色質排斥區(qū)（直徑約155 nm） 或有絲分裂染色體的DNA環(huán)（Hell et al., Chem. Sci., 2019; Spahn et al., Nano Lett., 2019）。

線粒體內(nèi)膜在不同生理條件下可發(fā)生重塑，STED超高分辨技術曾展示了人類細胞中相鄰的嵴連接（crista junctions, CJs）以可逆和平衡的方式動態(tài)地相互作用和分離，使用不同的蛋白標記或兩種親脂性內(nèi)膜特異性染料對嵴膜（cristae membranes, CM）進行染色，進一步揭示了嵴經(jīng)歷了連續(xù)的膜重塑循環(huán)，這些事件伴隨著不同嵴內(nèi)膜電位隨時間的波動，作者利用多種技術提出了一個CJ動力學模型，該模型在機制上與CM重塑相關，代表了在單個線粒體內(nèi)發(fā)生的嵴膜分裂和融合事件（Kondadi et al., EMBO reports, 2020）。結合STED超高分辨技術以及電子顯微技術，Gemmink等shouci顯示了在人體骨骼肌切片中，PLIN2和PLIN5（perilipin 2和perilipin 5）并不是共定位，而是分別并排定位于細胞內(nèi)脂滴（Intramyocellular lipid droplets , LD）的不同膜位點，PLIN5除了位于細胞質外，還位于線粒體附近以及線粒體和脂滴的相互作用位點，支持PLIN5參與促進脂肪酸從LD釋放，用于線粒體脂肪氧化的觀點，PLIN2和PLIN5的空間分布，將有助于我們理解生理和病理生理條件下的肌細胞脂滴脂解（Gemmink et al., BBA - Molecular and Cell Biology of Lipids,  2018）。

內(nèi)質網(wǎng)（ER）由相互連接的膜片和小管組成，超高分辨率顯微鏡發(fā)現(xiàn)了密集排列、快速移動的內(nèi)質網(wǎng)小管，被傳統(tǒng)光學顯微鏡誤認為是膜片，這也說明了在活細胞中以高時空分辨率重新審視內(nèi)質網(wǎng)結構的經(jīng)典觀點的重要性。Schroeder等利用活細胞STED成像shouci在活細胞中測定了內(nèi)質網(wǎng)小管和膜片的納米級尺寸，揭示了內(nèi)質網(wǎng)區(qū)域內(nèi)的納米孔的存在，并表明膜片中的納米孔不同于均勻膜片和ER矩陣（Nixon-Abell et al., Science. 2016），而是代表了組成內(nèi)質網(wǎng)子域的膜結構局部連續(xù)體的元素，這與教科書中對ER膜片和小管的定義不同，作為活細胞中ER的膜特征，納米孔提供了一個更全面的ER結構視圖，這可能有助于我們未來理解ER結構與疾病之間的關系（Schroeder et al., J. Cell Biol. 2018）。

STED超高分辨技術還助力理解細胞代謝狀態(tài)變化如何導致細胞器相互作用重新連接的關鍵。Jang等發(fā)現(xiàn)饑餓誘導的內(nèi)體募集MTM1（在人類x連鎖中央核肌病中突變的磷脂酰肌醇3-磷酸[PI(3)P] 3-磷酸酶）損害了腎小管內(nèi)質網(wǎng)膜與早期內(nèi)體之間PI(3)P依賴的接觸形成，導致內(nèi)質網(wǎng)小管轉化為片層，抑制線粒體分裂和持續(xù)的氧化代謝，揭示了細胞適應波動的營養(yǎng)環(huán)境中早期內(nèi)體-內(nèi)質網(wǎng)接觸位點在線粒體形態(tài)和功能中的作用（Jang et al., Science. 2022）。從內(nèi)質網(wǎng)運輸?shù)礁郀柣w的跨膜蛋白，干擾素基因刺激因子（Stimulator of interferon genes, STING），被蛋白激酶TBK1磷酸化從而實現(xiàn)信號轉導，STED超高分辨技術揭示了網(wǎng)格蛋白相關接頭蛋白復合物1（AP-1）將磷酸化的STING分類到網(wǎng)格蛋白包被的運輸囊泡中，并將其運送到內(nèi)溶酶體系統(tǒng)以降解和終止信號傳導（Liu et al., Nature. 2022）。

在神經(jīng)科學領域，STED技術被廣泛應用于研究神經(jīng)元突觸的結構和功能。例如Kedia等將培養(yǎng)的小鼠原代海馬神經(jīng)元及腦片用于觀察神經(jīng)元單個興奮性突觸及其區(qū)域內(nèi)蛋白質的快速動態(tài)過程，評估納米尺度的神經(jīng)組織異質性，提供了對神經(jīng)元結構和功能的新見解。在多種AD模型鼠的幫助下，他們發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白形成機制的主要成分（amyloid precursor protein，APP，和分泌酶）被離散地組織成局部濃度較高的納米結構域，并且這種局部改變特征成為阿爾茨海默病中的淀粉樣蛋白生成的決定性因素（Kedia et al., iScience, 2021; Kedia et al., STAR Protocols, 2021）。

STED超高分辨技術還被用于研究成熟樹突狀細胞（dendritic cells, DCs）捕獲HIV病毒，作者發(fā)現(xiàn)DCs的活化導致免疫球蛋白樣凝集素受體CD169 （Siglec-1）在特定的質膜區(qū)域形成納米團簇，增強了受體對攜帶唾液酸配體的神經(jīng)節(jié)苷脂的限制性濃度的親和力，與HIV-1顆粒或含神經(jīng)節(jié)苷脂的脂質體結合后，Siglec-1納米聚簇和以RhoA活性下降為特征的整體肌動蛋白重排增強，從而促進病毒顆粒在單個囊樣間隔內(nèi)的最終積累（Gutiérrez-Martínez et al., Elife, 2023）。STED還有助于理解黏著斑、緊密連接和初級纖毛的關鍵蛋白的排列及功能（Spiess et al., J. Cell Biol., 2018; Mangeol et al., Elife, 2022; Yang et al., Methods Mol Biol., 2016）

超高分辨顯微鏡可以探索微觀世界的無限可能性，已經(jīng)chedi改變了科學研究的方式。在細胞生物學領域，它被用于研究亞細胞結構，如微絲、微管、肌動蛋白等，細胞器如線粒體、溶酶體等，分子分布和細胞膜動態(tài)、觀察蛋白質的相互作用；在神經(jīng)科學領域，它可用于觀察神經(jīng)元的亞細胞結構和突觸的細節(jié)，有助于解剖和理解神經(jīng)系統(tǒng)的結構和功能，以及神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病的機制；在癌癥研究領域，被用于研究癌細胞的特征、蛋白質分布以及腫瘤微環(huán)境，這對于癌癥的早期診斷和治療規(guī)劃非常重要；在材料科學領域，它被用于研究納米材料的結構和性質、幫助科學家精確控制和制備納米結構；在藥物研發(fā)領域，它可用于研究藥物靶標蛋白的定位和與其他分子的相互作用，助力藥物設計和篩選；在微生物領域，規(guī)避了電子顯微鏡無法進行活體成像等弊端，可以更加推進微生物學發(fā)展。隨著未來技術的進一步發(fā)展和完善，STED將在揭示生命現(xiàn)象的微觀機制方面展現(xiàn)出更大的潛力，STED技術將朝向更高的成像速度、更深的成像深度以及更廣的應用范圍發(fā)展。

超高分辨顯微鏡的成像原理基于破解傳統(tǒng)顯微鏡的分辨極限，通過結構照明、圖像重建和單分子成像等策略，實現(xiàn)對微小結構的高分辨率成像。超高分辨顯微鏡雖已取得了顯著的應用突破，然而仍存在挑戰(zhàn)，包括技術的精進、多模態(tài)成像、樣品準備和數(shù)據(jù)分析的復雜性。

超高分辨成像技術通常需要高度復雜的設備和精密的校準，這使得其設備成本相對較高，若能降低設備成本，加上開源軟件和自動化工作流程的使用，將使超高分辨成像技術更易于使用和共享。超高分辨技術通常對于三維成像和大樣本的深度成像有限制，需要克服分辨率和深度之間的權衡。同時超高分辨成像的時間分辨率還可以繼續(xù)提升，雖然目前SIM和MINFLUX更適合觀察活細胞動態(tài)過程，但時間分辨率的提高仍然是一個挑戰(zhàn)，特別是對于極短時間尺度的大視野或多點實時成像，能夠更深入地探索微觀世界并獲得更多信息。在科學研究的需求下，多模態(tài)或多尺度成像將與不同的超高分辨技術相結合，例如，結合光學成像和質譜成像，從分子水平到組織水平提供生命活動更全面的信息；也可以發(fā)展高通量的樣品處理和成像技術，以便更快速地獲得大規(guī)模的數(shù)據(jù)。

樣品準備在超高分辨成像中具有重要作用，新的標記技術和熒光探針的發(fā)展將提高成像的靈敏度和特異性，開發(fā)更友好、無損傷的樣品準備方法，甚至包括無標記成像技術以減少樣品標記的需求，獲將更為便利。

超高分辨成像數(shù)據(jù)可能受到噪聲和偽跡的影響，這需要高級的圖像處理技術來減少其影響，以獲得準確的圖像。超高分辨成像生成的數(shù)據(jù)量大，數(shù)據(jù)存儲和傳輸、處理和分析這些大數(shù)據(jù)需要強大的計算資源和高效的算法。深度學習和人工智能技術有望在數(shù)據(jù)分析中發(fā)揮越來越重要的作用，實現(xiàn)自動處理和實時解釋和反饋圖像數(shù)據(jù)。

總的來說，盡管超高分辨成像面臨一些挑戰(zhàn)，但其前景充滿希望。未來，我們可以期待更多技術的發(fā)展，以進一步提高分辨率和擴大應用領域，如更高分辨率、更高靈敏度和更快成像速度和更大更深的成像范圍。超高分辨顯微鏡的應用也將繼續(xù)擴展到生物醫(yī)學研究的各個領域，為我們解決更多重要問題，如疾病機制、藥物研發(fā)、個性化醫(yī)學和生態(tài)系統(tǒng)健康等。超高分辨顯微鏡技術的未來展望是光明的，它將繼續(xù)推動科學研究向前邁進，揭示微觀世界的微小奧秘，為改善生活質量和解決全球挑戰(zhàn)做出貢獻。

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