了解自發熒光的常見原因以及如何將其從共聚焦顯微鏡圖像中去除。根據應用的不同，自發熒光的來源可能有很多種，但幸運的是，同樣也有很多的解決方案--從更換介質到使用熒光壽命成像和近紅外染料。

引 言

熒光顯微鏡改變了我們對生物學的理解。在細胞內以高空間分辨率定位特定分子事件的能力使人們對從基因表達通路到藥物相互作用的一切都有了深入的了解。

隨著現代共聚焦顯微鏡技術的進步，其靈敏度也在不斷提高。就像任何高靈敏的測量一樣，一個根本的問題是信噪比，背景噪聲可能會掩蓋信號中的微小變化。

在熒光共聚焦顯微鏡中，最大的噪聲源之一是自發熒光。去除這種背景對于能夠理解樣本中存在的信號的細微差別是至關重要的。在這篇綜述中，我們將探索如何通過一些快速固定方法和一些現代技術，如熒光壽命成像，來消除自發熒光，這些技術在軟件和顯微硬件的進步下變得更容易使用。

自發熒光產生的原因

自發熒光有許多潛在的原因，而且在單個樣品中通常有多個來源。首先，細胞本身可能是內源性自發熒光的來源。一些常見的來源是NADH，黃素，脂褐素，膠原和彈性蛋白，以及植物樣品中的葉綠素和木質素。換句話說，他們很難擺脫。

除了細胞自身組分帶來的自發熒光外，樣品在成像前的處理過程也會引入額外的背景熒光。這可以是任何東西，從藥物處理到封片劑。在嘗試去除自發熒光之前，確定其來源是很重要的。

消除自發熒光的方法

01了解你的樣品

如果你遇到了自發熒光的問題，首先要做的是嘗試通過調查你的樣本來隔離根源。當你開始你的實驗時，制備一個未標記的對照樣品，以確定染色過程是否會帶來背景熒光。

了解你的自發熒光光譜也很重要。這可以使用光譜掃描來確定。光譜掃描將有助于實驗優化和避免自發熒光中的強信號區。

02優化熒光團亮點

一旦你對你的自發熒光光譜有了一個很好的了解，下一步就是優化你的熒光團選擇。如果自發熒光和你的熒光團的光譜非常緊密地重疊，那么你的信號很有可能會被自發熒光所掩蓋。在這種情況下，選擇光譜遠離背景自發熒光的熒光團。例如，如果你的自發熒光在光譜的藍色區域，把你的熒光團移到綠色或紅色。

在選擇熒光團時，請選擇新型探針，如Alexa Fluor、Dylight或ATTO。這些染料往往更亮、更穩定，而且激發和發射波段更窄，這使得只從熒光團中選擇信號變得更容易。如果你的顯微鏡能檢測到它們，近紅外染料是避免自發熒光問題的一個很好的方法，因為這些波長在生物樣本中很少發現。能夠檢測到近紅外染料還有一個額外的好處，那就是能夠擴大可用于多色實驗的通道數量。

選擇熒光團后，不要盲目使用包裝上列出的濃度進行實驗，這一點很重要。通常情況下，需要對熒光團進行滴定實驗，在你的樣本上測試不同的濃度。這可以讓你看看哪種濃度能夠獲得超好的背景反差，哪種濃度能夠獲得很低的自發熒光。使用制造商的說明書作為指南，建立熒光團的稀釋梯度，覆蓋范圍略大于推薦的范圍。對照你的樣品測試這些稀釋液，找出哪個能給你最合適的信號。

03優化您的顯微鏡設置

共聚焦顯微鏡上的設置能夠大大影響在你的圖像中的目標信號和自發熒光。您可以通過調整光譜檢測范圍來盡可能多地減少自發熒光信號。根據顯微鏡的不同，有不同的方法可以做到這一點，但最靈活的選擇是選擇白激光和光譜式檢測器。這意味著你可以精確地調節到達樣品的和檢測器的光的波長以及通過檢測器的波長。可以對記錄在捕獲圖像中的信號時進行非常精細的控制，并提供充分的機會來消除自發熒光。

圖1：當比較自發熒光和熒光團的光譜時，選擇一個與自發熒光信號不重疊的熒光團。

04處理你的樣本

自發熒光通常不是來自樣本，而是來自成像前的處理過程。例如包埋劑、組織培養液和塑料器皿都可能是自發熒光的來源。

如果你正在進行活細胞成像實驗，那么考慮在成像前用預熱的無酚紅培養基或透明的緩沖鹽水溶液替換你的正常培養液。除了pH指示劑酚紅(440 nm可以激發出高強度熒光)外，培養基和補充劑(如FBS)還可以包含許多蛋白質和小分子，它們本身就有熒光信號，如果不去除它們，所有這些都可以形成強大的自發熒光背景。如果您確實決定將細胞切換到一種新的培養基進行實時成像，重要的是要意識到這可能會導致細胞行為和表型發生意想不到的變化，因此根據您正在研究的內容，您可能需要首先使細胞適應新的培養基。

用同樣的顯微鏡裝置預先測量培養皿的自發熒光也是必要的，看看這是否是自發熒光的來源。如果是這樣的話，試著去除自發熒光的玻璃底培養皿。

在對暴露于化學物質的活檢和組織樣本進行成像時，也可以看到類似的問題。一個常見的例子是消化道，如果它暴露在具有強烈熒光特征的抗生素(如四環素)中，它可能會有大量的自發熒光。在這種情況下，用緩沖鹽水沖洗或小心使用溶劑就可以很容易地去除熒光。

如果你需要固定細胞，固定方法會對自發熒光有很大的影響。考慮使用福爾馬林和戊二醛的替代品，在成像前盡量不要儲存固定樣本太長時間，因為自發熒光會隨著時間的推移而增加。

05軟件

雖然通過實驗設計避免自發熒光是很好的，但有時這是不可能的。在這些情況下，可以通過計算解決你的自發熒光問題。使用您的顯微鏡軟件或開源解決方案(如ImageJ)，可以分析包含自發熒光的像素，并嘗試將其從整體圖像中減去[1]。不過，請注意，計算方法可能很復雜。有許多不同的方法和算法可供選擇，所以建議多嘗試幾種方法和算法，看看哪種效果好。重要的是要記住，這些方法通常會降低熒光團信號和自發熒光的強度，所以要小心使用，要知道在增加背景的對比度和降低信號強度之間通常是需要權衡的。

06固定后去除自發熒光

一旦你準備好樣品并將其儲存在冰箱里，就會覺得任何自發熒光都會一直存在。雖然在樣品制備階段消除自發熒光比較容易，但即使在處理后也可以采取一些步驟。

有許多化學處理方法可以減弱自發熒光信號。其中一些是商品化可以買到的，而另一些則可以很容易地用常用的實驗室化學品如蘇丹黑B、乙醇銨等來制備[2，3]。

在顯微鏡下，光漂白往往具有負面含義，在激光調得稍高的情況下，花了很長時間尋找最佳圖像后，會失去熒光信號。然而，對于自發熒光，漂白可以是你的朋友。在添加熒光團之前，您可以用高強度LED燈處理您的樣品，以漂白所有的背景自發熒光。之后，您選擇的熒光團應該能與漂白的背景形成更強烈的對比[4]。

去除自發熒光的進階方法

顯微鏡和熒光成像技術在考慮到自發熒光的情況下不斷進步。在商用共聚焦顯微鏡中，有兩項創新正變得更加容易獲得。

01白激光

當涉及到減少自發熒光時，白激光(WLL)提供了很大的靈活性。首先，它們使您能夠微調您的激發波長，以匹配您選擇的熒光團，同時補充您的樣品的自發熒光光譜。

當涉及到熒光團的選擇時，白激光也為您提供了最大的靈活性，因為從理論上講，它們可以讓您使用所有已知的光譜熒光染料。波長從440 nm一直到近紅外端(790 nm)，在處理自發熒光時，激發近紅外熒光團的能力特別有利，而自發熒光更常見于光譜的藍色和綠色波段。

最后，基于光纖的WLL技術能夠實現脈沖激發，因此您可以在脈沖之間非常短的間隔內記錄熒光信號(計算光子數)。這是時間相關單光子計數(TCSPC)的基本要求，TCSPC是熒光壽命分析的金標準方法。有了WLL功能，FLIM可以內置到您的顯微鏡設置中，提供一種非常有效和相對簡單的方法來減少自發熒光和提高圖像對比度。

02熒光壽命成像

熒光壽命成像方法可用于消除自發熒光。壽命測量不只依賴于給定波長的熒光強度，而是反映了熒光團處于激發狀態的時間，這通常是納秒級的。這是非常有用的，因為你的背景自發熒光和你的熒光團有重疊光譜的可能性相對較高。然而，它們具有相同壽命的可能性要小得多。這意味著壽命測量可以用來區分自發熒光和你的熒光團信號，即使它們看起來在相同的光譜范圍內。以這種方式區分熒光信號的能力意味著，使用壽命測量可以從幾乎任何熒光信號中收集有意義的信息，甚至包括自發熒光。雖然壽命測量傳統上是一項相對復雜的技術，但硬件和軟件的改進使其更容易整合到任何共焦顯微鏡工作流程中。

圖2：左邊的熒光顯微鏡圖像，不能區分熒光信號和背景自發熒光。在右邊的圖像中，熒光壽命被用來區分葉綠體中的自發熒光(藍色)和所需的細胞膜熒光信號(綠色)。

總結和結論

自發熒光不一定會毀了你的實驗

當你只有有限數量的珍貴樣本時，重要的是不要讓任何東西影響你的實驗數據的質量。自發熒光是一種常見的現象，如果你聽之任之，它可能會毀了你的實驗。然而，對于自發熒光，有很多解決方案，從簡單地改變在樣品處理過程中使用的試劑到使用技術先進的顯微鏡和檢測器。

為自發熒光做好準備是阻止它影響你實驗的方法。通過做好準備，你可以在實驗設計中做出減少或消除背景熒光的選擇。

參考文獻：

1.J. M. Powell, N. W. Plummer, E. L. Scappini, C. J. Tucker and a. P. Jensen, ?DEFiNE: A Method for Enhancement and Quantification of Fluorescently Labeled Axons,“ Front Neuroanat, 2018.

2.W. Baschong, R. Suetterlin and R. Laeng, ?Control of autofluorescence of archival formaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue in confocal laser scanning microscopy (CLSM).,“ J Histochem Cytochem, vol. 49, no. 12, 2001.

3.M. Viegas, T. Martins, F. Seco and A. do Carmo, ?An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues.,“ Eur J Histochem, vol. 51, no. 1, 2007.

4.S. Y, I. P and C. A, ?Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.,“ J Vis Exp, no. 127, 2017.

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