熒光劑與熒光顯微鏡配合使用，可觀察標本中的特定細胞成分。試劑可以是熒光染料（如 ATTO Rho6G（羅丹明））、熒光蛋白（如 GFP（綠色））或免疫熒光染色劑（如 ATTO 488-抗體共軛物）。熒光蛋白在相關(guān)細胞蛋白中表達與遺傳相關(guān)。它們通常用于研究活細胞。在某些情況下，熒光蛋白會導(dǎo)致有關(guān)細胞蛋白的功能障礙或誤解。如果蛋白質(zhì)克隆不可能或不切實際，例如涉及組織學(xué)標本，則可使用免疫熒光染色等技術(shù)來觀察感興趣的細胞蛋白質(zhì)。為此，抗體與不同的熒光染料相連，以便直接或間接地與目標結(jié)構(gòu)結(jié)合。甚至還有針對特定應(yīng)用的活細胞染料品種，可以觀察細胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）、線粒體和高爾基體。還有一些功能測試可對活細胞進行標記，以跟蹤細胞增殖和凋亡等過程，以及區(qū)分活細胞和死細胞（活/死檢測）。即使是非生物物質(zhì)，如細胞中的鈣（Ca）離子，也可以用熒光鈣指示劑來檢測。

主要經(jīng)驗

1、熒光顯微鏡可使用多種染料來研究生物標本并觀察特定的細胞成分。

2、科學(xué)家可以利用點擊化學(xué)的優(yōu)勢，使用非天然氨基酸與抗體和納米抗體對生物大分子進行正交熒光標記。

3、有許多熒光染料可供使用。例如：與熒光標記抗體結(jié)合的染料、FITC 和 TRITC、ATTO 染料、DNA/RNA 染色劑（如 DAPI 和 Hoechst 染料）、用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色的 DiOC6(3)、用于離子成像的 fura-2、fluor-3、鈣綠、SBFI 和 PDFI，以及用于功能檢測的 ATTO 染色試劑盒。

4、如列表所示，每種染料在激發(fā)光譜和發(fā)射光譜中都有一個明顯的峰值。當同時使用幾種染料時，如用于多重分析和空間生物學(xué)，必須了解激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的重疊會導(dǎo)致錯誤的陰性或陽性結(jié)果，或使數(shù)據(jù)模糊不清。

本文將介紹常用的熒光染料并概述其特性。熒光顯微鏡借助熒光染料、熒光蛋白或使用抗體的免疫熒光染色來研究特定的細胞成分。由于熒光劑種類繁多，熒光顯微鏡可用于檢查蛋白質(zhì)、核酸、聚糖、細胞器和其他細胞結(jié)構(gòu)。

熒光染料和顯微鏡

熒光劑與熒光顯微鏡配合使用，可觀察標本中的特定細胞成分。試劑可以是熒光染料（如 ATTO Rho6G（羅丹明））、熒光蛋白（如 GFP（綠色））或免疫熒光染色劑（如 ATTO 488-抗體共軛物）。熒光蛋白通過基因連接，在相關(guān)細胞蛋白中表達[1]。它們通常用于研究活細胞。在某些情況下，熒光蛋白會導(dǎo)致有關(guān)細胞蛋白的功能障礙或誤解。如果蛋白質(zhì)克隆不可能或不切實際，例如涉及組織學(xué)標本，則可使用免疫熒光染色等技術(shù)來觀察感興趣的細胞蛋白質(zhì)。為此，抗體與不同的熒光染料相連，以便直接或間接地與目標結(jié)構(gòu)結(jié)合。甚至還有針對特定應(yīng)用的活細胞染料品種，可以觀察細胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）、線粒體和高爾基體。還有一些功能測試可對活細胞進行標記，以跟蹤細胞增殖和凋亡等過程，以及區(qū)分活細胞和死細胞（活/死檢測）。即使是非生物物質(zhì)，如細胞中的鈣（Ca）離子，也可以用熒光鈣指示劑來檢測。下文概述了常用的熒光染料。

利用點擊化學(xué)進行熒光標記

一般來說，"點擊化學(xué) "利用的是無有害副產(chǎn)物、化學(xué)收率高和產(chǎn)物穩(wěn)定的化學(xué)反應(yīng) [2]。科學(xué)家可以利用點擊化學(xué)來開發(fā)化學(xué)反應(yīng)，通過將小單元連接在一起，快速可靠地生成物質(zhì)。這使他們能夠使用非天然氨基酸 (UAA) 對生物大分子與抗體和納米抗體進行正交熒光標記。ATTO-TEC 和其他公司生產(chǎn)的疊氮和炔烴官能化染料可用于點擊化學(xué)應(yīng)用 [3]。點擊化學(xué)反應(yīng)的例子包括銅催化的 Huisgen 疊氮烷烴環(huán)化反應(yīng)，在染料和目標分子之間形成三唑連接；以及作為點擊試劑的 DBCO 衍生物染料，用于無催化、應(yīng)變促進的疊氮烷烴環(huán)化反應(yīng) [3]。

免疫熒光染料

通過熒光標記抗體與細胞中特定的相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合，就可以用熒光顯微鏡對這些蛋白質(zhì)進行研究。就組織學(xué)標本而言，無法使用熒光蛋白，因為標本一般來自不表達任何熒光蛋白的生物體。此外，如果有有效的抗體，使用免疫熒光技術(shù)比熒光蛋白技術(shù)要快得多。

免疫熒光利用了抗體與抗原的特異性結(jié)合親和力。它采用了兩種不同的方法。直接免疫熒光是簡單的方法，它將熒光標記的抗體直接與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合。不過，在大多數(shù)情況下使用的是間接免疫熒光。它需要兩種抗體，其中第一種（第一抗體）與目標蛋白質(zhì)結(jié)合，但本身不帶熒光標記。第二種抗體（第二抗體）與第一抗體結(jié)合，專門攜帶熒光染料。間接免疫熒光有幾個優(yōu)點。一方面會產(chǎn)生放大效應(yīng)，因為往往不止一種二抗與一抗結(jié)合。另一方面，用相關(guān)熒光染料標記的二抗通常比一抗更容易找到。

FITC和TRITC

異硫氰酸熒光素(FITC)是一種有機熒光染料，目前仍常用于免疫熒光和流式細胞術(shù)中。它的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別為 495 納米和 517 納米，可借助其活性異硫氰酸酯基團與蛋白質(zhì)的氨基、巰基、咪唑酰基、酪氨酰基或羰基結(jié)合，從而與不同的抗體偶聯(lián)。FITC 是用于熒光顯微鏡的染料之一，也是 ATTO 488、Alexa 488 等其他熒光染料的前身。它的熒光活性源于其自身的大共軛芳香電子結(jié)構(gòu)，在藍色光譜中會被光所激發(fā)。用 ATTO 488 染色的標本示例見圖 1。

圖 1：甲醇固定的 MDA-MB-468 細胞圖像，其中 EGF 受體用 AZ-271 標記的 affibody（紅色）染色，Ki67 用抗 Ki67 的兔 IgG（一級）染色，ATTO-647N 標記的抗兔的驢 IgG-fab2-片段（二級，藍色）染色，管蛋白抗體用抗 beta 管蛋白的鼠 IgG（一級）染色，ATTO 488 標記的抗鼠的驢 IgG-fab2-片段（二級，綠色）染色、藍色）、小鼠 IgG 抗 beta 管蛋白抗體染色（一級）和 ATTO 488 標記的驢 IgG-fab2-片段抗小鼠抗體染色（二級，綠色）。

經(jīng)常與FITC配合使用的一種染料是同出一門的TRITC（四甲基羅丹明-5-（和6）-異硫氰酸酯）。與 FITC 不同，TRITC 不是熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明還具有大型共軛芳香電子系統(tǒng)，這使其具有熒光特性。TRITC被波長為550納米的綠色光譜光激發(fā)。其發(fā)射波長為 573 納米。抗體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是以活性異硫氰酸酯基團為基礎(chǔ)的。

盡管 FITC 和 TRITC 仍被廣泛使用，但由于它們的光穩(wěn)定性低、水溶性差，屬于弱熒光染料，因此不建議用于顯微鏡檢查。

其他類型的染料

ATTO 染料或標簽包括許多親水性熒光染料、熒光淬滅劑以及大斯托克斯偏移和氧化還原染料，它們都用于熒光顯微鏡。有些 ATTO 染料基于基本熒光物質(zhì)，如羅丹明、羰基羅丹明、噁嗪或吖啶。例如 ATTO 386H、ATTO 465、ATTO 532、ATTO 647N 和 ATTO 680。例如，ATTO 488 的激發(fā)波長為 500 納米，發(fā)射波長為 520 納米。它的特性與 FITC 相似，但穩(wěn)定性更好，亮度更高，pH 值敏感性更低。用不同 ATTO 染料染色的樣本示例見圖 2 和圖 3。

圖 2：相分離的巨-單拉美柱狀泡（赤道掃描），液相用 ATTO 488-DPE（綠色）標記，液相用 ATTO 647N-DOPE（紅色）標記。

圖 3：甲醇固定 MDA-MB-468 細胞，用小鼠 IgG 抗 beta-微管蛋白（一級）和用 ATTO 488 標記的驢 IgG-fab2-片段抗小鼠（二級）微管蛋白抗體染色。

DNA/RNA（核酸）染色

有時，科學(xué)家可能需要研究細胞中的核酸，例如，借助熒光顯微鏡，通過檢測細胞核來計數(shù)特定類型的細胞或確定它們的確切位置。最常見的DNA染色劑之一是DAPI （4',6-二氨基-2-苯基吲哚），主要與DNA雙螺旋富含A-T的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合態(tài)相比，DAPI在DNA上的熒光強度增加。它被紫外線激發(fā)，大波長為 358 納米。發(fā)射光譜寬，峰值為461納米。弱熒光也可以檢測到RNA結(jié)合。在這種情況下，發(fā)射轉(zhuǎn)移到500納米。有趣的是，DAPI能夠滲透完整的細胞膜。因此，該染料既可用于固定細胞也可用于活細胞。

其他常用的 DNA 染色劑有 Hoechst 染色。Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 都是雙苯并咪唑類化合物，具有夾雜 DNA 中富含腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）區(qū)域的傾向。與 DAPI 類似，這些染料被紫外光激發(fā)，與 DNA 結(jié)合時在 455 納米處有發(fā)射值（未結(jié)合時為 510 至 540 納米）。Hoechst 染色劑具有細胞滲透性，因此可用于固定細胞和活細胞。此外，它們的毒性也低于 DAPI。

碘化丙啶是一種膜滲透性 DNA 染色劑，通常用于區(qū)分細胞培養(yǎng)中的活細胞和死細胞，因為它無法進入完整的細胞。碘化丙啶也是一種插層劑，但對不同的堿沒有結(jié)合偏好。在與核酸結(jié)合的狀態(tài)下，它的激發(fā)波長為 538 納米，發(fā)射波長為 617 納米。未結(jié)合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射大值向低波長和低強度移動。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結(jié)合。要區(qū)分 DNA 和 RNA，必須使用適當?shù)暮怂崦浮?/p>

吖啶橙是一種無需任何修飾就能區(qū)分 DNA 和 RNA 的染料。與 DNA 結(jié)合時，其激發(fā)/發(fā)射波長為 502 nm/525 nm；與 RNA 結(jié)合時，其激發(fā)/發(fā)射對波長為 460 nm/650 nm。此外，該染料還可以進入酸性間室中，如溶酶體。陽離子染料在酸性間室中質(zhì)子化。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙受藍色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射較強。該染料通常用于識別凋亡細胞，因為凋亡細胞有很多被吞噬的酸性間室。

間室與細胞器特異性染料

有許多特定的染料可用于研究細胞區(qū)室，如溶酶體、內(nèi)體或液泡（存在于酵母中，如 S. cerevisiae）以及細胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER)、高爾基體和細胞核。圖 4 和圖 5 舉例說明。

細胞區(qū)室和細胞器可使用 ATTO-TEC 公司的抗體標記試劑盒進行染色 [3]。科學(xué)家可以利用多克隆和單克隆 IgG 抗體或其他蛋白質(zhì)（如 ATTO 488 和 ATTO 643 結(jié)合物）對標本進行有效標記。

在研究蛋白質(zhì)分泌時，通常會對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行染色。DiOC6(3) [3,3′-二己基氧雜羰花青碘化物]是染色該細胞器的一種經(jīng)典染料，它是一種綠色熒光親脂性染料，可滲透細胞并偏愛 ER 膜[4]。不過，它仍能與線粒體等其他細胞器的膜結(jié)合 [4]。

還可以借助于對細胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)來染色感興趣區(qū)域。這種方法的一個例子是小麥胚芽凝集素(WGA)的使用，它與存在于質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特異結(jié)合。

圖 4：小鼠小腦皮層三重標記矢狀切片中的浦肯野細胞或神經(jīng)元。圖像中，紅色表示鈣賓蛋白-D28k 鈣結(jié)合蛋白（抗鈣賓蛋白-D28k/Cy3），綠色表示神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）[抗 GFAP/Cy5]，藍色表示細胞核（Hoechst 33258）。

圖 5：用 DAPI（細胞核，藍色）、抗-α-tubulin-ATO 488（微管，綠色）和抗-TOMM20-ATO 643（線粒體，紅色）染色的 U2OS 人 骨肉瘤 細胞。圖像采用共聚焦顯微鏡拍攝。

間室與細胞器特異性染料

許多重要的細胞過程，包括細胞器和囊泡運動、細胞運動、細胞分裂、細胞分裂、細胞信號傳導(dǎo)和維持細胞形狀，都涉及肌動蛋白。肌動蛋白是一組球狀多功能蛋白質(zhì)，構(gòu)成細胞骨架中的微絲。可用于所有 ATTO 染料的類膠體素共軛物可為肌動蛋白絲的染色和可視化提供強有力的工具[3]。

磷脂在細胞結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要作用。磷脂具有兩親性，能夠形成脂質(zhì)雙分子層，因此是構(gòu)成生物膜（如血漿膜和細胞內(nèi)膜）的主要成分。磷脂等標記膜探針是研究細胞的有用工具。

結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜擴散等。ATTO-TEC 公司提供多種磷脂，這些磷脂以甘油為基礎(chǔ)，帶有一個或兩個脂肪酸（親油基團）和一個磷酸鹽單酯殘基（親水基團），磷酸鹽單酯殘基可進行熒光標記[3]。例如，1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE）、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DMPE）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1-palmitoyl-2-hydroxy-snglycero-3-phosphoethanolamine (PPE)、1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DLPE)。

離子成像

就神經(jīng)元研究、基因活動或細胞運動而言，研究細胞中的離子濃度是很有意義的。鈉、鈣、氯或鎂離子對許多不同的細胞活動有著深刻的影響。通常，借助熒光標記的螯合劑可以捕獲離子，當這些螯合劑與適當?shù)碾x子結(jié)合時，就會改變自身的光譜特性。標記螯合劑的例子有鈣指示劑 fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4 和鈣綠。對于鈉的檢測，通常使用SBFI（鈉結(jié)合苯并呋喃間苯二甲酸鈉）或鈉綠。此外，PBFI（鉀結(jié)合型苯并呋喃間苯二甲酸酯）還能檢測鉀離子。

功能實驗

“功能實驗"是一個統(tǒng)稱，指的是評估各種功能的標準化實驗，這些功能可以用熒光標志物進行可視化觀察。這些標記物可以包括但不限于上述任何標記技術(shù)和熒光團。ATTO-TEC 可為許多功能檢測提供染色試劑盒，可輕松應(yīng)用于各種標本。這些試劑盒利用多克隆和單克隆 IgG 抗體或其他帶有 ATTO 染料的蛋白質(zhì) [3]。功能檢測的一個例子就是被廣泛使用的活體/死體檢測。兩個熒光團分別用于標記活細胞和死細胞。在同時掌握這兩個值的情況下，就可以評估細胞的總體健康狀況。將這些信息與其他標記聯(lián)系起來，甚至可以加深對任何潛在過程的了解。

熒光染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰是什么？

使用熒光染料時，必須注意其激發(fā)和發(fā)射波長峰、溶解性、量子產(chǎn)率、亮度和光穩(wěn)定性。根據(jù)具體應(yīng)用，應(yīng)使用適當?shù)娜玖稀晒馊玖霞捌涓髯缘募ぐl(fā)和發(fā)射波長峰的完整列表見下表（PDF 文件）。關(guān)于熒光的基本原理[5]，如與熒光染料激發(fā)光和發(fā)射光之間的波長差有關(guān)的斯托克斯偏移，讀者可參閱參考文獻 4。請注意，峰值是每種染料獨特的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的一部分。在一次實驗中選擇幾種染料同時使用時（如用于多路復(fù)用和空間生物學(xué)應(yīng)用），研究人員應(yīng)注意由于串擾或滲漏造成的激發(fā)和發(fā)射光譜重疊，這可能導(dǎo)致假陰性或假陽性，或以其他方式使數(shù)據(jù)模糊不清。細胞和組織中的天然熒光蛋白或生物大分子產(chǎn)生的自發(fā)熒光也會使熒光成像失真。在進行植物或藻類實驗時，尤其需要考慮到這一點。不過，如果使用激發(fā)波長長于 550 nm 的染料，可以減少自發(fā)熒光造成的干擾。充分了解染料光譜也很重要，這樣才能對激發(fā)光源（如 LED、弧光燈或激光線）以及發(fā)射濾光器和探測器做出選擇。ATTO 染料光譜[3]示例見下圖 6。有關(guān) ATTO 染料的激發(fā)和發(fā)射波長峰、溶解度、量子產(chǎn)率、亮度和光穩(wěn)定性的信息和數(shù)據(jù)，請參閱參考文獻 2。

圖 6：ATTO 488（綠色曲線）和 ATTO 553H（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線。可以清楚地看到兩個發(fā)射光譜的重疊。紅線表示 488 發(fā)射濾波器的波段。

參考文獻：

1、C.Greb, J. DeRose, Introduction to Fluorescent Proteins：光譜和光度特性概述， Leica Microsystems 科學(xué)實驗室 (2023)。

2、K.Horisawa, 利用點擊化學(xué)對生物分子進行特異性和定量標記，F(xiàn)ront.Physiol.2014 秒系統(tǒng)生物學(xué)檔案，第 5 卷第 5 條。20160677. 請勿：10.3389/fphys.2014.00457.

3、目錄，熒光標簽和染料，ATTO-TEC (2024/2025) Leica Microsystems。

4、A.J. Koning、P.Y. Lum、J.M. Williams、R. Wright，DiOC6 染色顯示活酵母細胞的細胞器結(jié)構(gòu)和動力學(xué)，《細胞運動和細胞骨架》（1993 年），第 25 卷，第 2 期。2, pp：10.1002/cm.970250202.

5、W.Ockenga, J. DeRose, An Introduction to Fluorescence：光致發(fā)光現(xiàn)象背后的基本理論--熒光和磷光，科學(xué)實驗室（2023 年）徠卡微系統(tǒng)。

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